Utah, 1912. Indiana Jones, giovane boy scout, cerca di impedire che la croce d’oro di Coronado cada in mano di alcuni trafficanti di reperti. La strappa dalle mani dei criminali con lo scopo di consegnarla all’autorità affinché possa stare in un museo, e dopo un duro inseguimento, giunge a casa. Il padre è però troppo preso dai suoi appunti per ascoltarlo, ed il giovane è costretto a rendere la croce ai trafficanti poiché, come si viene a scoprire, lo sceriffo, sopraggiunto a casa sua, è dalla loro parte, e li riconoscerà quali “legittimi proprietari” del manufatto. Nel 1938, ventisei anni dopo, nella costa portoghese un ormai adulto Indiana Jones lotta nuovamente per la croce, ma questa volta riesce a recuperarla, portarla al suo college, e mostrarla all’amico Marcus Brody.

Jones viene contattato dal miliardario Walter Donovan affinché lo aiuti a proseguire la ricerca del Santo Graal, il calice usato da Gesù Cristo nell’Ultima Cena e nel quale fu raccolto il sangue del Redentore. Le ricerche del mitico reperto, giunte a buon punto in seguito alla scoperta di un’indicazione su di una tavola di pietra spezzata, erano state poi interrotte dalla misteriosa sparizione di uno degli archeologi impegnati: nientemeno che Henry Jones Sr., padre di Indy.

Partito per Venezia, Indy fa la conoscenza dell’archeologa Elsa Schneider, ed insieme a lei raggiunge l’indicazione gemella di quella della tavola di pietra, scolpita su di uno scudo su una tomba nelle catacombe della città. Il ritrovamento viene però ostacolato dalla “Fratellanza della Spada Cruciforme”, gruppo che protegge il Graal, e da uno di loro Indy apprende che il padre è tenuto prigioniero dai nazisti nel castello austriaco di Brunwald.

Dopo aver scoperto il doppiogioco di Elsa, Indy libera l’anziano professore e con lui si dà alla fuga, non prima di aver recuperato a Berlino l’importante libretto di appunti del padre(dove incontra addirittura, faccia a faccia Hitler che gli fa un autografo proprio nel libretto nel padre).

Giunti dopo molte peripezie – e a costo della vita – nell’antico tempio di Alessandretta, dove è custodito il Graal, i due devono nuovamente confrontarsi con i tedeschi e con Donovan, interessato al calice per l’immenso potere che ne deriverebbe.

Minacciato da Donovan, Indy è costretto ad affrontare tre difficili prove per raggiungere la stanza del Graal e salvare la vita al genitore, gravemente ferito da Donovan; superatele, si trova faccia a faccia con il cavaliere crociato che da 700 anni custodisce il calice, che gli propone l’ultimo enigma: tra tante coppe nella stanza, deve scegliere, e bere, il vero Graal, altrimenti morirà. Il sopraggiunto Donovan, ovviamente, sbaglia e muore, invecchiando e decomponendosi rapidamente, mentre Indy riesce nell’impresa e salva il padre. La condizione era che il calice non esca dal tempio, ma Elsa, cercando di portare via il Graal, viene inghiottita con esso da un crepaccio apertosi improvvisamente nel pavimento. Indiana cade a sua volta nel crepaccio, costretto a scegliere tra la salvezza e il Graal: sceglierà la fuga, sotto lo sguardo benevolo del cavaliere guardiano.